Citometria în flux este o metodă de cercetare citologică utilizată pentru analiza aprofundată a celulelor. Avantajul său este că vă permite să studiați fiecare celulă în mod individual. Acest tip de analiză ajută la evaluarea mai multor parametri în sute de celule în câteva secunde. Drept urmare, citofluorimetria este considerată una dintre cele mai rapide și mai precise metode de analiză disponibile în prezent pentru oamenii de știință și clinicieni.
Principiu
Principiul citometriei în flux se bazează pe măsurarea împrăștierii luminii și a luminiscenței (fluorescenței) celulelor. Suspensia celulară este trecută ca un flux cu viteză mare prin celula citometrului, unde este iradiată cu un laser. Acolo se realizează și așa-numita focalizare hidrodinamică. Mecanismul său este că fluxul de la celulă cu particulele studiate la ieșire curge în jetul extern, care are o viteză mai mare. Ca rezultat, particulele sunt aliniate într-un lanț ordonat.
Precelulele sunt etichetate cu coloranți fluorescenți speciali (fluorocromi). Datorită lor, raza laserexcită o strălucire secundară. Semnalele luminoase primite sunt înregistrate de detectoare. Ulterior, informațiile sunt procesate folosind algoritmi software care vă permit să numărați populațiile de celule individuale care diferă în anumite criterii.
Cercetarea cu microscopia convențională nu reușește adesea să facă distincția între diferite celule, deoarece arată la fel. Citofluorimetria poate furniza alte date (integritatea structurii ADN), analiza expresia proteinelor, supraviețuirea celulelor.
Deoarece excitația fluorocromilor necesită fascicule de lumină cu lungimi de undă diferite, precum și diferite tipuri de detectoare, instalațiile moderne sunt echipate cu mai multe canale de detecție (de la 4 la 30). Numărul de emițători laser poate fi de la 1 la 7. Dispozitivele mai complexe permit studii multiparametrice ale mai multor proprietăți ale particulelor simultan.
Avantaje și dezavantaje
Beneficiile citometriei în flux includ:
- viteză mare de procesare (înregistrarea a până la 30 de mii de evenimente într-o secundă);
- posibilitatea de a studia un număr mare de celule (până la 100 de milioane într-o probă);
- Cuantificarea intensității luminii fluorescente;
- analiza fiecărei celule;
- studiu simultan al proceselor eterogene;
- separarea automată a datelor în funcție de populațiile de celule;
- vizualizarea de calitate a rezultatelor.
O altă caracteristică a acestei tehnologii este aceeaparticula analizată poate fi colorată cu mai multe soluții fluorescente. Datorită acestui fapt, are loc un studiu cu mai mulți parametri.
Dezavantajele includ complexitatea echipamentului tehnic și necesitatea pregătirii speciale a probelor.
Citometre
Primele dispozitive de acest tip au apărut deja în 1968 în Germania, dar s-au răspândit mult mai târziu. În prezent, toate dispozitivele care funcționează prin metoda citometriei în flux pot fi împărțite în 2 tipuri:
- dispozitive care măsoară radiația fluorescentă (două sau mai multe lungimi de undă), împrăștierea luminii de 10° și 90° (detector de împrăștiere cu unghi mic și lateral);
- dispozitive care, pe lângă măsurarea mai multor parametri celulari, sortează automat în grupuri în funcție de aceste criterii.
Detectorul de împrăștiere înainte este conceput pentru a determina dimensiunea celulei, iar dispozitivul de împrăștiere laterală vă permite să obțineți informații despre prezența granulelor intracelulare, raportul de volum al citoplasmei și nucleul.
Citometrele clasice, spre deosebire de microscoapele cu lumină, nu permit obținerea unei imagini a unei celule. Cu toate acestea, în ultimii ani, au fost dezvoltate dispozitive combinate care sunt capabile să combine capacitățile unui microscop și ale unui citofluorimetru. Acestea vor fi discutate mai jos.
Citometre imagistice
Pentru instrumentele utilizate în citometria în flux clasică,o caracteristică este caracteristică: dacă în populația de celule analizate sunt înregistrate evenimente rare, atunci nu există nicio modalitate de a evalua care este esența lor. Aceste particule pot fi fie rămășițele celulelor moarte, fie un grup rar al acestora. În dispozitivele convenționale, astfel de date sunt excluse din fluxul general de evenimente, dar acestea pot fi de o valoare deosebită pentru analiza științifică și clinică.
Noua generație de citometre de flux imagistice vă permite să capturați o imagine a fiecărei celule care trece în flux prin zona detectorului. Este ușor să îl vedeți făcând clic pe zona corespunzătoare a diagramei, care este afișată pe monitorul computerului.
Domenii de aplicare
Citometria în flux este o metodă universală care este utilizată în multe domenii ale medicinei și științei:
- imunologie;
- oncologie;
- transplantologie (transplant de măduvă osoasă roșie, celule stem);
- hematologie;
- toxicologie;
- biochimie (măsurarea acidității în interiorul celulei, studiul altor parametri);
- farmacologie (crearea de noi medicamente);
- microbiologie;
- parazitologie și virusologie;
- oceanologie (studiul fitoplanctonului pentru a evalua starea corpurilor de apă și alte sarcini);
- nanotehnologie și analiză de microparticule.
Imunologie
Sistemul imunitar uman este format dintr-o mare varietate de celule. Citometria în flux în imunologie face posibilă evaluarea structurii și funcțiilor acestora, adică efectuarea morfofuncționalăanaliză.
Astfel de cercetare ajută la înțelegerea naturii complexe a imunității. Fenotipurile celulare se modifică ca urmare a activării de către antigeni, a dezvoltării patologiilor și a altor factori. Citofluorometria poate separa subpopulațiile de celule imune într-un amestec complex și poate evalua toate modificările acestora în timp.
Oncologie
Una dintre cele mai importante sarcini în oncologie este diferențierea celulelor în funcție de tipul lor. Principiul analizei prin citometrie în flux în oncohematologie se bazează pe următorul fenomen: atunci când o probă este tratată cu un colorant fluorescent special, aceasta se leagă de proteinele citoplasmatice. După divizarea în celulele care proliferează activ, conținutul său scade la jumătate. În consecință, intensitatea luminiscenței celulare scade de două ori.
Există și alte moduri de a detecta celulele în proliferare:
- utilizarea coloranților care leagă ADN-ul (iodură de propidiu);
- folosirea uracilului etichetat;
- înregistrarea unui nivel crescut de expresie a proteinelor cicline, care sunt implicate în reglarea ciclului celular.
