Cromatografia este una dintre metodele de separare a substanțelor. Este utilizat pentru analiza ulterioară calitativă și cantitativă a proprietăților fizice și chimice ale microparticulelor. O variație a acestei tehnologii este cromatografia de afinitate. Ideea diferențierii compușilor proteici folosind proprietatea afinității moleculare este cunoscută în știință de câteva decenii. Cu toate acestea, ea și-a primit dezvoltarea abia în ultimii ani, după introducerea materialelor hidrofile foarte poroase folosite ca matrice. Această metodă permite rezolvarea atât a problemelor analitice (separarea substanțelor și identificarea lor), cât și a problemelor preparative (purificare, concentrare).
Esență
Cromatografia de afinitate (de la cuvântul latin affinis - „adiacent”, „înrudit”) se bazează pe interacțiuni de afinitate, care sunt formarea de legături foarte specifice între o moleculă distanțier (ligand sau afinant) și o moleculă țintă. Aceste mecanisme sunt larg răspândite în natură (conexiune între mediatori sau hormoni și receptori, anticorpi șiantigene, hibridizarea polinucleotidelor și alte tipuri de procese). În medicină, cromatografia de afinitate a fost folosită în scopuri practice din 1951
Componentele sunt separate după cum urmează:
- soluția de lucru care conține substanța de izolat este trecută prin sorbent;
- ligandul depus pe matricea sorbantului reține această substanță;
- este concentrat (acumulare);
- extracția substanței izolate din sorbent prin spălare cu un solvent.
Această metodă vă permite să izolați celule întregi. Diferența față de cromatografia de sorbție tradițională este că există o legare biospecifică puternică a componentei izolate de sorbent, care este caracterizată de o selectivitate ridicată.
Adsorbanți
Următoarele substanțe sunt utilizate ca adsorbanți:
- Compuși de gel pe bază de agaroză, o polizaharidă obținută din agar. Cele mai frecvent utilizate sunt 3 soiuri: sepharose 4B, CL (agaroză reticulată) și affi-gel. Ultima compoziție este un gel modificat de agaroză și poliacrilamidă. Are o inerție biologică mai mare, rezistență chimică și termică ridicată.
- Silice (gel de silice).
- Sticlă.
- Polimeri organici.
Pentru a elimina obstacolele mecanice în timpul contactului ligandului, se folosesc substanțe suplimentare pentru a-l separa de purtător (peptide, diamine, poliamine, oligozaharide).
Echipament
Echipamentul pentru cromatografie de afinitate include următoarele unități principale:
- rezervoare de stocare pentru faza mobilă (eluent);
- pompe de în altă presiune pentru alimentare medie (cel mai adesea alternative);
- filtru pentru curățarea eluanților de praf;
- dispozitiv de dozare;
- coloană cromatografică pentru separarea amestecului;
- detector pentru detectarea componentelor separate care părăsesc coloana;
- inregistratoare de cromatograme și unitate cu microprocesor (computer).
Pentru a reduce cantitatea de aer dizolvat, heliul este trecut mai întâi prin faza mobilă. Pentru a modifica concentrația de eluant, sunt instalate mai multe pompe controlate de programator. Coloanele cromatografice sunt realizate din oțel inoxidabil (pentru cerințe sporite de rezistență la coroziune), sticlă (opțiune universală) sau acril. În scopuri pregătitoare, diametrul lor poate varia de la 2 la 70 cm. În cromatografia analitică se folosesc microcoloane Ø10-150 µm.
Pentru a crește sensibilitatea detectorilor, în amestec se introduc reactivi, care contribuie la formarea unor substanțe care absorb mai multe raze în regiunea ultravioletă sau vizibilă a spectrului.
Metodologie
Există 2 tipuri principale de cromatografie de afinitate lichidă:
- Coloană, în care coloana este umplută cu o fază staționară și un amestec este trecut prin ea cu un fluxeluent. Separarea poate avea loc sub presiune sau gravitație.
- Strat subțire. Eluentul se deplasează de-a lungul stratului adsorbant plat sub influența forțelor capilare. Adsorbantul se aplică pe o placă de sticlă, tijă ceramică sau cuarț, folie metalică.
Principalele etape de lucru includ:
- prepararea adsorbantului, fixarea ligandului pe purtător;
- alimentarea amestecului de separare la coloana cromatografică;
- încărcare fază mobilă, legarea componentelor prin ligand;
- înlocuire de fază pentru a izola substanța legată.
Destinație
Cromatografia de afinitate este utilizată pentru a izola următoarele tipuri de substanțe (tipul de ligand utilizat este indicat între paranteze):
- analogi ai inhibitorilor, substraturilor și cofactorilor enzimatici (enzime);
- substanțe bioorganice cu semne de apartenență genetică, viruși și celule (anticorpi);
- carbohidrați cu greutate moleculară mare, polimeri monozaharidici, glicoproteine (lectine);
- proteine nucleare, nucleotidiltransferaze (acizi nucleici);
- receptori, proteine de transport (vitamine, hormoni);
- proteine care interacționează cu membranele celulare (celule).
Această tehnologie este folosită și pentru a obține enzime imobilizate, iar legarea lor de celuloză permite producerea de imunosorbanți.
Cromatografia proteinelor care leagă ADN
Izolarea proteinelor care leagă ADN-ul se realizează folosindheparină. Acest glicozaminoglican este capabil să lege o gamă largă de molecule. Cromatografia de afinitate a proteinelor din acest grup este utilizată pentru a izola substanțe precum:
- factori de inițiere și alungire a translației (sinteza moleculelor de acid nucleic și a proteinelor);
- retrictaze (enzime care recunosc anumite secvențe în ADN-ul dublu catenar);
- ADN ligaze și polimeraze (enzime care catalizează unirea a două molecule pentru a forma o nouă legătură chimică și sunt implicate în replicarea ADN-ului);
- inhibitori de serin protează care joacă un rol important în procesele imunitare și inflamatorii;
- factori de creștere: fibroblast, Schwann, endotelial;
- proteine ale matricei extracelulare;
- receptori hormonali;
- lipoproteine.
Demnitate
Această metodă este una dintre cele mai specifice pentru izolarea compușilor reactivi (enzime și agregate mai mari - viruși). Cu toate acestea, este folosit nu numai pentru a izola substanțe biologic active.
Detecția anticorpilor în cantități mici, evaluarea cantitativă a acidului poliadenilic, determinarea rapidă a maselor moleculare ale dehidrogenazelor, îndepărtarea anumitor poluanți, studiul cineticii de activare a formei inactive a tripsinei, structura moleculară a omului interferoni – nu aceasta este întreaga listă de studii în care se utilizează afinitatea.cromatografia. Utilizarea în clinică se datorează avantajelor sale precum:
- Capacitate de curățare eficientăproteine, polizaharide, acizi nucleici. Ele diferă ușor în proprietățile lor fizice și chimice și își pierd activitatea în timpul hidrolizei, denaturării și altor tipuri de tratament utilizate în alte metode.
- Viteza de separare a substanțelor, natura dinamică a procesului.
- Nu este nevoie de purificare specială a enzimelor și omogenizare a izoenzimelor pentru a determina constantele de disociere.
- Capabil să separe o gamă largă de substanțe.
- Consum redus de liganzi.
- Posibilitatea separării substanțelor în volume mari.
- Proces reversibil de legare a macromoleculelor biologice.
Această tehnică poate fi combinată cu altele, pentru a impune un câmp suplimentar (gravitațional, electromagnetic). Acest lucru vă permite să extindeți capacitățile tehnice ale cromatografiei.
Inginerie enzimatică
Datorită acestei metode, a început dezvoltarea activă a unei noi ramuri a biotehnologiei - ingineria enzimatică.
Cromatografia de afinitate pentru izolarea enzimelor are următoarele avantaje:
- obținerea de enzime în cantități mari ca urmare a timpului mai mic, ca urmare - reducerea prețului acestora;
- imobilizarea enzimelor poate extinde în mod semnificativ domeniul de aplicare a acestora în medicină și industrie;
- Asocierea enzimelor cu un suport solid insolubil face posibilă studierea influenței micromediului și a direcției reacțiilor, care joacă un rol important în procesele naturale și fiziologice.
