PCR, sau reacția în lanț a polimerazei, este o tehnică de laborator sofisticată care este utilizată pe scară largă în medicină și în alte domenii științifice. Diagnosticarea PCR a devenit la un moment dat o adevărată descoperire în știință.
Descriere
PCR cantitativ este un tip de PCR în timp real.
Aceasta este înțeleasă ca o variantă a PCR, în care cinetica reacției este înregistrată constant, ceea ce face posibilă evaluarea calitativă a conținutului de secvențe de nucleotide ADN specifice într-un amestec molecular complex.
Metoda PCR cantitativă va fi discutată mai detaliat mai jos.
Esența analizei
Metodele culturale și serologice sunt folosite în special pentru a diagnostica infecțiile. Sub primul, se determină anticorpi la un agent patogen infecțios din serul sanguin. În al doilea, materialul biologic prelevat de la o persoană bolnavă este folosit pentru a semăna un mediu specific care este favorabil creșterii coloniilor de patogeni. Diagnosticare în ambelecazul poate dura zile sau săptămâni.
Examinarea PCR poate fi efectuată cu diferite materiale biologice care sunt obținute de la o persoană bolnavă. Sângele și alte medii și fluide patologice, fiziologice și biologice acționează ca probe. Puteți efectua PCR cu fecale sau urină.
Infecțiile atipice și virale sunt cel mai adesea diagnosticate prin PCR cantitativ, deoarece pot să nu fie ușor de diagnosticat din cauza naturii specifice a procesului patologic provocat de acestea. Pentru a determina astfel de infecții, este nevoie de timp, timp în care în organism încep să se producă anticorpi, determinate prin metode serologice. Dar acest lucru este inacceptabil în unele cazuri.
Metoda de efectuare
Metoda PCR - detectarea de laborator a infecției în probe izolate de la pacient (in vitro).
Pentru a efectua o reacție în lanț a polimerazei, este necesar un set de reactivi speciali.
Materialul de testat este introdus în eprubete cu reactivi. Eprubetele sunt plasate într-un aparat special - un amplificator PCR, care este conceput pentru a amplifica (mărește numărul) fragmentelor de ARN sau ADN dorite, amplificatorul PCR funcționează într-un mod ciclic. În orice ciclu, dacă probele conțin secvența de ARN sau ADN a agentului patogen, atunci în soluție se acumulează tot mai multe copii ale particulelor acestor acizi nucleici. Puteți determina prezența agentului patogen și cantitatea acestuia în probe.
Tipuri de PCR
Analiza calitativă prin PCR vă permite să obțineți următorul rezultat:
- negativ atunci când agentul patogen de interes nu este găsit în probe;
- pozitiv dacă în probe sunt găsite secvențe care sunt caracteristice unui anumit agent patogen.
Cu un rezultat PCR pozitiv, putem vorbi cu o acuratețe de 95% despre prezența unei infecții diagnosticate. În același timp, acuratețea seturilor PCR utilizate în scopuri de diagnostic ajunge la 100%.
De obicei, 5% dintre rezultatele incorecte sunt determinate de factorul uman. De exemplu, încălcările tehnicii de analiză și stocare a reactivilor pot reduce semnificativ acuratețea studiului.
PCR cantitativ definește conceptul de încărcare virală. Este posibil să se determine câte seturi de ADN patogen au fost în probele prelevate de la pacient.
Severitatea infecției este direct proporțională cu creșterea numărului acestora. De asemenea, puteți determina succesul terapiei pentru a reduce încărcătura virală.
Trimitere pentru biomaterial PCR
PCR cantitativ se efectuează în clinică, în principal dimineața. În timpul unei vizite la medic, pacientului i se va spune ce trebuie luat: răzuire, frotiuri, urină sau sânge. PCR poate detecta agenți patogeni indiferent de nivelul de contaminare al materialului.
Pentru o analiză pozitivă, în teorie, este necesară prezența unui singur agent patogen în probe. În practică, ei încearcă să creeze condiții și mai favorabile. Există câteva recomandări pentru aceasta:
- dacă iau o răzuire sau un tampon de la organele genitaleorgane, trebuie să vă abțineți de la actul sexual cu trei zile înainte de studiu;
- nu poți să faci duș cu medicamente antibacteriene sau să te speli înainte de analiză;
- trei ore înainte de a lua un frotiu din uretra, trebuie să aveți răbdare și să nu vă goliți intestinele.
Nu respectați aceste reguli atunci când donați sânge.
Cum sunt interpretate rezultatele analizei PCR cantitative?
Evaluarea cantitativă a rezultatelor obținute
Într-o serie de situații clinice apare problema eficacității tratamentului și/sau a dinamicii procesului patologic. Astfel de întrebări sunt deosebit de relevante atunci când se examinează persoanele cu infecții cronice (virusul imunodeficienței umane, hepatita B și C). La diagnosticare, acestea se bazează pe faptul că acumularea de ampliconi (produse PCR) este proporțională cu prezența de copii ale genei dorite în proba analizată.
Desigur, luarea în considerare a rezultatelor PCR cantitative se face prin electroforeză pe gel cu studiul intensității semnalelor speciale PCR. De asemenea, o condiție prealabilă pentru o evaluare cantitativă corectă a rezultatelor obținute este probele de control pozitive și fiabile care conțin un număr cunoscut de copii ale genei dorite (de exemplu, o mie de copii ale genei hepatitei C pentru o reacție PCR). Mai multe diluții în serie ale controlului cantitativ permit generarea curbelor de calibrare și sunt utilizate pentru a evalua conținutul genocopiilor clinice din specimenele clinice.
În definiția PCR cantitativă, o realizare cheie a fost creareasonde ADN fluorescente care sunt adăugate amestecului de reacție simultan cu primeri simpli și vă permit să urmăriți procesul PCR în timp, adică PCR în timp real.
Metodologia TaqMan se referă la sinteza de sonde ADN fluorescente care sunt specifice părții de mijloc a ampliconului și au două etichete la capete. Una dintre ele este o etichetă fluorescentă, a doua este o moleculă de extindere a acestei fluorescențe.
Un dispozitiv special, care este un hibrid dintre un fluorimetru și un termobloc-amplificator, efectuează măsurători constante ale fluorescenței în fiecare eprubetă (principiul PCR în timp real). După 20-40 de cicluri de PCR, se vor obține curbe individuale pentru fiecare probă. Numărul de copii ale genei dorite care este conținut în proba de testat poate fi calculat din curbele de calibrare cu probe de control.
De asemenea, o caracteristică importantă a implementării PCR prin metoda fluorescentă este că nu este necesară deschiderea tuburilor cu un amestec PCR atunci când se ține cont de rezultate. Acest lucru reduce posibilitatea contaminării încăperii cu produse de amplificare și nu este nevoie să alocați zone speciale de lucru pentru electroforeză.
Ce arată o transcriere PCR cantitativă?
Ce se descoperă?
Printr-o metodă precum PCR cantitativă se constată modificări calitative ale genelor: inserții, deleții și mutații punctuale. Dar cu unele tulburări ereditare, simptomele corespunzătoare apar ca răspuns la o modificare a conținutului anumitor gene.
MulțumescAnaliza cantitativă dă un rezultat numeric, cel mai adesea în UI/ml. Aceasta înseamnă că într-un mililitru de probă de testat a fost găsit un anumit număr de copii ale ARN-ului sau ADN-ului agentului patogen, măsurate în unități internaționale.
În funcție de amploare, severitatea infecției este diagnosticată. De obicei, sângele este testat pentru a determina încărcătura virală, deoarece virușii se mișcă liber în sânge în timpul bolii.
Funcții
PCR cantitativ într-un test de sânge are două caracteristici.
- Analiza se efectuează în prezența primerilor sau trifosfaților dezoxiribonucleozidici, care sunt marcați cu o etichetă fluorescentă sau radioactivă pentru a determina cu precizie conținutul produsului PCR format.
- În procesul PCR, încheiați reacția mai devreme înainte să apară prea multe produse PCR. Acest lucru se datorează faptului că în stadiul final de saturație, când există o mulțime de produse PCR, atât enzima în sine, cât și substraturile acționează ca verigi limitatoare ale acestei reacții. Sfârșitul următorului ciclu de PCR în astfel de condiții nu se mai caracterizează printr-o dublare a numărului de produse PCR, se nivelează diferențe cantitative nesemnificative între diferitele probe, care sunt destul de clar definite în stadiile incipiente după trecerea printr-o serie de cicluri de reacție..
Costul diagnosticării PCR
Cercetarea PCR are un cost, care depinde de ce fel de infecție va fi testată, de metodologia de analiză și de materialul de testat. Pentru a determina o infecție, va trebui să cedezi200-800 de ruble. Se adaugă și o taxă pentru preluarea de biomaterial - aproximativ 400 de ruble.
