ADN-ul recombinant sunt molecule formate prin tehnici de recombinare genetică de laborator pentru a combina material genetic din surse multiple. Este posibil deoarece moleculele de ADN ale tuturor organismelor au aceeași structură chimică și diferă doar prin secvența de nucleotide din interiorul acesteia.
Creație
Clonarea moleculară este un proces de laborator folosit pentru a crea ADN recombinant. Este una dintre cele două metode cele mai utilizate pe scară largă, alături de reacția în lanț a polimerazei (PCR). Vă permite să controlați replicarea oricărei anumite secvențe de ADN alese de experimentator.
Există două diferențe fundamentale între metodele ADN recombinant. Una este că clonarea moleculară implică replicarea într-o celulă vie, în timp ce PCR implică in vitro. O altă diferență este că prima metodă permite tăierea și lipirea secvențelor ADN, în timp ce a doua este îmbunătățită prin copierea comenzii existente.
ADN vectorial
Obținerea ADN recombinant necesită un vector de clonare. Este derivat din plasmide sau virusuri și este un segment relativ mic. Alegerea vectorului pentru donarea moleculară depinde de alegerea organismului gazdă, de mărimea ADN-ului care urmează să fie donat și de exprimarea moleculelor străine. Segmentele pot fi combinate folosind diverse metode, cum ar fi clonarea enzimei de restricție/ligază sau asamblarea Gibson.
Clonare
În protocoalele standard, clonarea implică șapte pași.
- Selectați organismul gazdă și vectorul de clonare.
- Obținerea unui vector ADN.
- Formarea ADN-ului clonat.
- Crearea ADN-ului recombinant.
- Introducerea acestuia în organismul gazdă.
- Selectare de organisme care îl conțin.
- Selectare de clone cu inserții ADN dorite și proprietăți biologice.
După transplant în organismul gazdă, moleculele străine conținute în constructul recombinant pot fi sau nu exprimate. Exprimarea necesită restructurarea genei pentru a include secvențe care sunt necesare pentru producerea ADN-ului. Este folosit de mașina de traducere a gazdei.
Cum funcționează
ADN-ul recombinant funcționează atunci când celula gazdă exprimă o proteină din gene recombinate. Expresia depinde de înconjurarea genei cu un set de semnale care oferă instrucțiuni pentru transcrierea acesteia. Acestea includ promotorul, legarea ribozomilor și terminatorul.
Apar probleme dacă genaconține introni sau semnale care acționează ca terminatori pentru gazda bacteriană. Acest lucru duce la rezilierea prematură. Proteina recombinată poate fi procesată, pliată sau degradată necorespunzător. Producerea sa în sistemele eucariote are loc de obicei în drojdii și ciuperci filamentoase. Utilizarea cuștilor pentru animale este dificilă din cauza necesității unei suprafețe de sprijin puternice pentru mulți.
Proprietățile organismelor
Organismele care conțin molecule de ADN recombinat au fenotipuri aparent normale. Aspectul, comportamentul și metabolismul lor de obicei nu se schimbă. Singura modalitate de a demonstra prezența secvențelor recombinante este examinarea ADN-ului însuși folosind testul de reacție în lanț a polimerazei.
În unele cazuri, ADN-ul recombinant poate avea efecte dăunătoare. Acest lucru se poate întâmpla atunci când fragmentul său care conține un promotor activ este situat lângă o genă a celulei gazdă anterior tacută.
Folosiți
Tehnologia ADN-ului recombinant este utilizată pe scară largă în biotehnologie, medicină și cercetare. Proteinele sale și alte produse pot fi găsite în aproape fiecare farmacie occidentală, clinică veterinară, cabinet medical, laborator medical sau biologic.
Cea mai obișnuită aplicație este în cercetarea de bază, unde tehnologia este esențială pentru o mare parte a muncii de astăzi în științele biologice și biomedicale. ADN-ul recombinant este utilizat pentru identificarea, maparea și secvența genelor și pentru a le determinafuncții. Sondele ADNr sunt utilizate pentru a analiza expresia genelor în celule individuale și în țesuturile organismelor întregi. Proteinele recombinante sunt utilizate ca reactivi în experimentele de laborator. Câteva exemple specifice sunt oferite mai jos.
chimozină recombinantă
Găsită în abomasum, chimozina este o enzimă necesară pentru a face brânza. A fost primul aditiv alimentar modificat genetic folosit în industrie. O enzimă recombinată produsă microbiologic, identică structural cu o enzimă derivată din vițel este mai ieftină și este produsă în cantități mai mari.
Insulină umană recombinantă
Înlocuiește practic insulina derivată din surse animale (de exemplu, porci și bovine) pentru tratamentul diabetului insulino-dependent. Insulina recombinantă este sintetizată prin introducerea genei insulinei umane în bacterii din genul Eterichia sau drojdie.
hormon de creștere
Prescris pentru pacienții a căror glanda pituitară nu produce suficient hormon de creștere pentru a susține dezvoltarea normală. Înainte ca hormonul de creștere recombinant să devină disponibil, acesta a fost obținut din glanda pituitară a cadavrelor. Această practică nesigură i-a determinat pe unii pacienți să dezvolte boala Creutzfeldt-Jakob.
Factor de coagulare recombinant
Aceasta este o proteină de coagulare a sângelui care se administrează la pacienții cu forme de hemofilie cu tulburări de sângerare. Ei nu pot producefactorul VIII în cantități suficiente. Înainte de dezvoltarea factorului VIII recombinant, proteina a fost produsă prin procesarea unor cantități mari de sânge uman de la donatori multipli. Aceasta presupune un risc foarte mare de transmitere a bolilor infecțioase.
Diagnosticarea infecției cu HIV
Fiecare dintre cele trei metode utilizate pe scară largă pentru diagnosticarea infecției cu HIV a fost dezvoltată folosind ADN recombinant. Un test de anticorpi folosește proteina ei. Detectează prezența materialului genetic HIV folosind reacția în lanț a polimerazei de transcripție inversă. Dezvoltarea testului a fost posibilă prin clonarea moleculară și secvențierea genomilor HIV.
